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Génomes khoisan et bantou complets d’Afrique australe

Quatre chasseurs-cueilleurs autochtones namibiens !Gubi, G/aq’o, D#kgao et !Aî (appelés ici KB1, NB1, TK1 et MD8, respectivement), chacun étant le membre le plus âgé de sa communauté, ont été choisis pour le séquençage du génome en fonction de leur groupe linguistique, de leur situation géographique et de la représentation de l’haplogroupe du chromosome Y (figure 1 et tableau supplémentaire 1). L’individu bantou est l’archevêque Desmond Tutu (ABT), qui représente les locuteurs Sotho-Tswana et Nguni (issus des vastes langues Niger-Congo), les deux plus grands groupes bantous d’Afrique australe.

Figure 1 : Carte de l’Afrique australe.
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La figure montre le groupement ethnique et les localités des participants à l’étude, KB1, NB1, TK1, MD8 et ABT (a-e, respectivement), les zones de climat aride et désertique et la distribution géographique des langues khoisan et Niger-Congo30. Les langues khoisan sont caractérisées par des clics, indiquant des consonnes supplémentaires. Le ! est un clic palatal, le / est un clic dentaire et le # est un clic alvéolaire26. Notez que l’haplogroupe du chromosome Y ABT a été déterminé en utilisant à la fois les données de génotypage et de séquençage générées par cette étude.

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Comme on s’attendait à ce que les génomes de nos participants à l’étude divergent davantage du génome de référence humain que ne le font les génomes yorubains, européens et asiatiques accessibles au public4,5,6,7,8, nous avons cherché à générer une séquence génomique qui offrirait une qualité suffisante pour la cartographie par rapport à la référence humaine et l’assemblage de novo. Par conséquent, le génome de KB1 a été séquencé avec une couverture de 10,2 fois en utilisant la plateforme Roche/454 GS FLX avec la chimie Titanium, donnant une longueur de lecture moyenne de 350 paires de bases (pb). Afin d’étudier les aspects de la structure du génome, des bibliothèques supplémentaires à insertion longue pour KB1 ont été séquencées à l’aide de la technologie paired-end Roche/454 Titanium, avec des tailles d’insertion allant jusqu’à 17 kilobases (kb) et une couverture de clones non redondants de 12,3 fois. Le génome de NB1 a été séquencé à l’aide de la même plateforme avec une couverture double. Le génome d’ABT a été séquencé avec une couverture de plus de 30 fois, à l’aide de la technologie à lecture courte d’Applied Biosystems, SOLiD 3.0. En outre, les génomes des cinq participants à l’étude ont été séquencés avec une couverture d’au moins 16 fois dans les régions codant pour les protéines (exomes) qui ont été enrichies par la capture de séquences Nimblegen (matrice de 2,1 M) et séquencées ensuite sur la plateforme Roche/454 Titanium (1,5 à 1,9 gigabases (Gb) de séquences par individu). Le tableau supplémentaire 2 rapporte le volume de données obtenu, tandis que le tableau supplémentaire 3 donne des statistiques sur les exomes.

Les données de séquence ont été validées par diverses techniques, notamment la comparaison des séquences du génome entier et des exomes, le séquençage du génome entier par une autre plateforme (Illumina, 23.2 fois pour KB1 et 7,2 fois pour ABT), le génotypage à haute densité (Illumina 1 Million SNPs), la comparaison des informations de profondeur de lecture avec les données d’hybridation génomique comparative, ainsi que la validation de variants sélectionnés à l’aide de la discrimination allélique TaqMan et/ou du séquençage Sanger. Nous estimons le taux de faux positifs de nos appels finaux de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) pour KB1 à 0,0009, et le taux de faux négatifs à 0,09 (voir Informations supplémentaires pour plus de détails).

Nous avons créé un assemblage de novo du génome KB1, en utilisant l’assembleur Phusion9. Les contigs assemblés totalisent 2,79 Gb, avec une taille de contigs N50 de 5,5 kb. La taille totale de l’échafaudage, y compris les lacunes estimées, est de 3,09 Gb, avec une taille d’échafaudage N50 de 156 kb. Le plus grand échafaudage assemblé s’étend sur 3,2 Mb. Souvent, les données de séquence Roche GS FLX ont produit des contigs et des échafaudages qui ne correspondent pas au génome humain de référence. Bon nombre de ces échafaudages correspondaient à des lacunes dans l’assemblage de référence humain actuel, y compris des lacunes de plus de 200 000 pb (voir Informations supplémentaires).

Des différences mononucléotidiques par rapport à l’assemblage du génome de référence humain (NCBI Build 36, également connu sous le nom de hg18) ont été identifiées pour les cinq génomes d’Afrique australe et comparées à celles de huit génomes personnels disponibles4,5,6,7,8. Dans ce qui suit, le terme « SNP » désigne une différence d’un seul nucléotide par rapport à l’assemblage de référence humain, sans inclure les insertions/délétions d’une base, et sans restriction sur la fréquence des allèles dans une population. Les SNP ont été appelés à l’aide des logiciels Newbler (pour Roche/454), Corona Lite (pour SOLiD) et MAQ10 (pour Illumina).

Conformément à l’opinion selon laquelle les Africains du Sud font partie des populations humaines les plus divergentes, nous avons identifié plus de SNP dans KB1, et dans une moindre mesure dans ABT, que ce qui a été rapporté dans d’autres génomes humains individuels (Fig. 2 et Tableau 1), bien qu’une partie de la variation du nombre de SNP puisse provenir de différences dans la technologie et les niveaux de couverture. Le nombre de SNP nouveaux (c’est-à-dire non observés précédemment chez d’autres individus) est beaucoup plus élevé pour KB1 et ABT que pour d’autres génomes entiers individuels (tableau 1). KB1 et ABT ont chacun environ 1 million de SNP qui ne sont pas partagés entre eux ou avec les génomes complets yorubains, asiatiques ou européens publiés4,5,6,7,8 (Fig. 2). Dans les 117 mégabases (Mb) d’intervalles contenant des exomes séquencés, le taux moyen de différences nucléotidiques entre une paire de Bushmen était de 1,2 par kilobase, contre une moyenne de 1,0 par kilobase différant entre un individu européen et asiatique. Le taux de SNP plus élevé chez les Bushmen est reflété par le décalage des lignes rouges et noires dans la Fig. 3b. La diversité autosomique des participants à l’étude se reflète dans la diversité des génomes mitochondriaux. Alors que les Européens présentent en moyenne environ 20 différences par rapport à la séquence de référence de Cambridge (CRS)11, nos participants d’Afrique australe présentent jusqu’à 100 SNP mitochondriaux par rapport à la CRS (tableaux supplémentaires 4 et 5 et figures supplémentaires 1 et 2). Plus important encore, malgré l’appartenance de toutes les séquences mitochondriales au même haplogroupe L0, jusqu’à 84 différences sont observées entre les génomes mitochondriaux de paires de participants (tableau supplémentaire 4).

Figure 2 : Relations à trois voies entre les SNP.
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Les SNP de KB1 sont comparés à ceux des Yorubains NA19240 et ABT (panneau de gauche), ainsi qu’à ceux d’un Américain d’ascendance européenne (J. C. Venter) et d’un individu chinois (YH) (panneau de droite). Les nombres sont donnés en milliers. Les positions de variantes qui apparaissent dans les huit génomes précédents ont été ignorées, ce qui a conduit à un nombre légèrement inférieur de SNP totaux (par exemple, 3 761 019 différences par rapport à l’assemblage de référence pour KB1, contre 4 053 781 si elles sont incluses) et à moins de SNP dans chaque intersection à trois voies. Des relations similaires sont trouvées lorsque d’autres individus des groupes géographiques sont examinés.

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Tableau 1 Nombre de SNP dans le génome et les régions séquencées contenant des exomes.contenant des régions
Figure 3 : Variation des densités de SNP.
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a, Un point chaud de SNP pour KB1 et J. Watson sur le chromosome 17 ; les deux individus sont hétérozygotes pour l’haplotype 17q21.3 H2. De chaque côté se trouvent des régions répétitives où les SNP ne peuvent pas être appelés (en gris). Les taux de SNP locaux sont divisés par le taux autosomique de l’individu, de sorte que les taux attendus sont de 1,0 (ligne pointillée horizontale). KB1 présente un enrichissement en SNP de près de 2,5 fois pour 650 000 bases. b, Distribution des SNP des génomes Bushmen (ligne rouge) et non-Bushmen (ligne noire), comparée aux positions des nucléosomes (tracé gris rempli), indiquant la région sans nucléosomes (NFR) et les nucléosomes -1 et +1. SCT, site de début de transcription.

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Pour déterminer si les nouveaux SNP représentent des allèles ancestraux ou sont apparus depuis la séparation des Bushmen des autres populations, nous avons examiné le nucléotide homologue dans le génome du chimpanzé. Les SNP qui correspondent au génome du chimpanzé indiquent que la différence est ancestrale, tandis que les différences par rapport au chimpanzé indiquent un allèle dérivé. Sur les 743 714 nouveaux SNP de KB1, le génome de référence humain correspond au génome du chimpanzé pour 87% d’entre eux, alors que le génome de KB1 ne correspond au chimpanzé que pour 6%. Pour les 7% restants, le nucléotide chimpanzé n’a pas pu être déterminé (6%) ou différait à la fois du Bushman et de la référence (1%). Ces fractions sont essentiellement inchangées si l’on tient compte des 3 600 appels SNP faussement positifs estimés (soit 0,0009 sur 4 millions), que l’on peut supposer apparaître comme de nouvelles variantes. Ainsi, très peu des différences nouvelles dans le génome de KB1 sont des nucléotides ancestraux conservés chez les Bushmen ; au lieu de cela, la grande majorité sont des changements qui se sont accumulés depuis que la lignée des Bushmen a divergé des autres populations humaines.

Le grand nombre de SNP nouveaux soulève des préoccupations quant à la capacité des tableaux de génotypage actuels à capturer efficacement la véritable étendue de la diversité génétique et de la structure des haplotypes représentée en Afrique australe. En évaluant le pourcentage d’hétérozygotie pour 1 105 569 SNP autosomiques à l’aide des puces Illumina actuelles, nous avons été surpris de constater une hétérozygotie plus faible dans le KB1 par rapport à un témoin européen apparié à la région (données supplémentaires et figures supplémentaires 3a, b), car il est bien connu que la diversité génétique est la plus élevée en Afrique. Cependant, l’analyse des données de séquençage du génome entier pour KB1 et ABT a révélé des pourcentages élevés de SNP hétérozygotes (59 % et 60 %, respectivement), comme prévu. Cette divergence souligne l’inadéquation des puces SNP actuelles pour analyser les populations d’Afrique australe.

La densité locale des SNP identifiés dans KB1 varie considérablement à travers le génome (figure supplémentaire 4), et cette variation de densité est également observée dans d’autres génomes individuels (données non présentées). Certains des points chauds sont communs à tous les individus examinés, tandis que d’autres montrent des différences locales frappantes entre les individus, comme le point chaud KB1 statistiquement significatif (P < 10-5 ; voir les informations supplémentaires) montré dans la Fig. 3a. Cette région correspond à l’inversion 17q21.312, qui contient plusieurs gènes, dont ceux codant pour CRHR1 (récepteur de l’hormone de libération de la corticotropine) et MAPT (protéine tau associée aux microtubules). L’analyse des variantes de séquence diagnostique ainsi que le typage direct d’un indel de 238 pb13 (figure supplémentaire 5) confirment que KB1 est hétérozygote pour l’haplotype H2 de 17q21.3, une découverte surprenante car l’allèle H2 se trouve à de faibles fréquences dans les populations non européennes12. La profondeur de lecture et l’array-CGH indiquent que l’allèle H2 porté par KB1 ne contient pas la duplication de 75 kb présente sur tous les allèles H2 européens analysés14,15,16 (figures supplémentaires 6a, b). L’haplotype H2 de KB1 peut représenter la séquence et la structure ancestrales de l’haplotype H2 qui était présent dans les populations africaines avant sa fréquence accrue dans les populations européennes et du Moyen-Orient12.

Nous avons également observé une tendance à l’échelle du génome pour des niveaux élevés de SNP dans les régions promotrices (Fig. 3b). Les éléments régulateurs des promoteurs ont tendance à s’enrichir près des frontières des nucléosomes, qui sont les endroits où nous avons observé des niveaux de SNP maximaux, en particulier dans les génomes composites des Bushmen. Il est possible qu’une fréquence accrue de SNP dans ces régions génomiques puisse entraîner des changements phénotypiques chez l’homme.

Nous avons identifié 27 641 substitutions d’acides aminés distinctes chez nos cinq participants, par rapport à la séquence de référence humaine, beaucoup se produisant chez plus d’un individu. Parmi celles-ci, 10 929 apparaissent dans un ou plusieurs des génomes personnels précédemment séquencés considérés ici, 3 566 supplémentaires se trouvent dans des bases de données publiques (voir Informations supplémentaires) et les 13 146 restantes sont nouvelles et réparties entre 7 720 gènes distincts. La discussion suivante sur les phénotypes putatifs pour les génotypes trouvés chez les Bushmen a pour but d’illustrer comment la présence de SNP observés et leur association antérieure avec des phénotypes peuvent conduire à des hypothèses testables. Il ne s’agit que de candidats pour les fonctions suggérées, et des tests expérimentaux doivent être menés pour les approfondir.

Sur les 14 495 (c’est-à-dire 10 929 + 3 566) SNP d’acides aminés précédemment identifiés, 621 ont été trouvés dans des bases de données fournissant des associations de maladies ou d’autres informations phénotypiques. Certains d’entre eux sont facilement liés au mode de vie des Bushmen, comme l’absence de l’allèle de persistance de la lactase d’origine européenne (une variante promotrice fonctionnelle du gène LCT) et de l’allèle SLC24A5 associé à une peau claire. Dans d’autres cas, la concordance avec la séquence de référence humaine est instructive, comme l’absence de l’allèle de résistance au paludisme Duffy null (DARC) spécifique à l’Afrique17. L’absence d’allèles de résistance au paludisme chez les populations de Bushmen pourrait avoir des conséquences importantes sur une population déjà en déclin de butineurs bien adaptés, lorsqu’ils sont contraints à un mode de vie agricole qui entraîne une augmentation des charges pathogènes17. Par conséquent, ces marqueurs génétiques peuvent permettre de retracer le taux d’adaptation de l’homme dans des environnements changeants18 (voir Informations supplémentaires).

Bien qu’un certain nombre de SNP observés chez les Bushmen aient été liés à des phénotypes dans d’autres groupes ethniques dans la littérature et les bases de données en ligne, il faut rester sceptique quant à la validité des associations non testées. Dans les informations supplémentaires, nous illustrons ce point avec l’entrée dbSNP rs1051339 pour le gène LIPA, qui est annotée dans une base de données publique comme étant associée au  » syndrome de Wolman « , une défaillance dévastatrice du métabolisme des lipides (figure supplémentaire 7).

Nous avons observé des SNP signalés comme étant associés à une physiologie améliorée (tableau supplémentaire 6). KB1, MD8, TK1 et ABT sont homozygotes pour un allèle de VDR associé à une densité minérale osseuse plus élevée ; KB1 est homozygote pour un allèle d’UGT1A3 associé à un métabolisme accru des endo- et xénobiotiques ; KB1, NB1 et ABT sont homozygotes pour un allèle d’ACTN3 associé à une performance accrue en matière de sprint et de puissance ; KB1 est hétérozygote pour un allèle de CLCNKB codant pour un canal chlorure qui a une plus grande capacité à réabsorber les ions chlorure du glomérule rénal – une propriété qui serait probablement avantageuse dans le désert. D’autres SNP intéressants incluent un qui conserve la fonction du gène CYP2G (Fig. 8a, b), et deux à des positions dans le gène du récepteur du goût TAS2R38 conférant la capacité de goûter un composé amer (phénylthiocarbamide), ce qui peut refléter un besoin chez les chasseurs-cueilleurs d’éviter les plantes toxiques (voir les informations supplémentaires pour une discussion détaillée).

Les 13 146 nouveaux SNP d’acides aminés rapportés ici constitueront une riche ressource pour les travaux futurs, fournissant de nombreux nouveaux sites fonctionnels candidats qui n’ont pas été inclus dans les études d’association du génome entier jusqu’à présent. Environ 25 % de ces SNP ont des implications fonctionnelles prédites par une série de méthodes informatiques (voir les informations supplémentaires). Les catégories de l’ontologie génétique qui sont représentées de manière proéminente dans les 6 623 gènes avec un ou plusieurs nouveaux SNP Bushmen (c’est-à-dire en excluant des 7 720 gènes avec de nouveaux SNP ceux qui sont uniques à ABT) comprennent de nombreuses fonctions connues pour évoluer rapidement chez les humains, telles que la réponse immunitaire, la reproduction et la perception sensorielle (tableau supplémentaire 7). Voir les informations supplémentaires pour des descriptions détaillées des analyses computationnelles des gènes liés au métabolisme des lipides et à la perception sensorielle.

Comme tous les participants à notre étude sont d’un âge avancé (∼80 ans) et apparemment en bonne santé, les nouvelles variantes codantes décrites dans cette étude peuvent être corrélées à l’état de santé et aux phénotypes sur toute la durée de vie humaine. Les participants Bushmen ont atteint leur âge avancé malgré des conditions de vie difficiles dues à des famines périodiques et à des maladies non traitées. Comme certains des allèles codants des Bushmen ont été associés à des maladies dans la littérature publiée, nos résultats peuvent aider à réévaluer ces rapports antérieurs, ainsi qu’à identifier les incompatibilités pharmacogénétiques potentielles spécifiques à la population de certains médicaments prescrits à l’échelle mondiale.

Des duplications segmentaires ont été détectées dans 17 601 gènes autosomiques distincts dans le génome KB1 et les nombres de copies estimés selon les procédures décrites précédemment19 (figure supplémentaire 6a, b). Les nombres de copies estimés à partir de la profondeur de lecture sont plus fiables pour les segments plus longs, nous avons donc spécifiquement ciblé les régions de plus de 20 kb. Au total, nous avons détecté 886 intervalles (chacun >20 kb) de duplication segmentaire autosomique (93,5 Mb), ce qui inclut 100 intervalles (3,9 Mb) dont la duplication n’est pas prédite dans l’échantillon NA18507 (un échantillon HapMap de Yoruba, au Nigeria)19. Grâce à l’array-CGH, 58 de ces intervalles (2,6 Mb) présentaient un nombre de copies accru dans KB1 par rapport à NA18507, le seul autre génome africain publié. L’ensemble des duplications validées comprend un intervalle de 140 kb sur le chromosome 10 couvrant le gène CYP2E1, qui code pour une protéine du cytochrome P450 induite par l’éthanol et métabolisant de nombreux substrats toxicologiques20 (figure supplémentaire 6a).

Puis, nous avons spécifiquement estimé les nombres de copies pour tous les gènes RefSeq autosomiques et conçu un réseau d’oligonucléotides personnalisé ciblant les gènes où KB1 et NA18507 sont prédits différer par au moins une copie. Cela a permis de valider 193 gènes comme différant en nombre de copies entre KB1 et NA18507 (53 où NA18507 a plus de copies et 140 où KB1 a plus de copies ; tableau supplémentaire 8). Pour 26 de ces gènes, on estime que KB1 a au moins deux copies de plus que NA18507, Han Chinese YH et J. Watson d’origine européenne. Cet ensemble de gènes comprend l’amylase salivaire (AMY1A, estimation du nombre de copies de KB1 = 15 ; cela peut correspondre à un mode de vie de fourrageur21), les défensines alpha (DEFA1, estimation du nombre de copies de KB1 = 12,5) et la γ-glutamyltransférase 1 (GGT1, estimation du nombre de copies de KB1 = 13,2).

Le séquençage et le génotypage étendu ont révélé des relations génétiques entre nos participants et d’autres groupes humains. Le placement des génomes mitochondriaux complets (tableau supplémentaire 9), y compris les femelles supplémentaires Tuu (KB2) et Juu (NB8) sur l’arbre maternel de la réf. 1 (figure supplémentaire 1a-c) a positionné nos participants dans la branche basale du clade L0. De manière surprenante, ABT a été placé dans le clade L0d, une lignée mitochondriale spécifique aux Bushmen. Nous avons identifié 75 (sur 1 220) SNP informatifs pour les Bushmen sur le chromosome Y (figure supplémentaire 9). Contrairement aux autres Bushmen, MD8 a montré une lignée bantoue sur le chromosome Y compatible avec ABT. L’analyse des marqueurs Y de la clade A (tableau supplémentaire 10), B (tableau supplémentaire 11) et E (tableau supplémentaire 12) a permis de valider les haplogroupes et la classification E1b1a8a d’ABT (http://ycc.biosci.arizona.edu/)22.

Nous avons effectué une analyse en composantes principales (ACP) à l’aide du logiciel EIGENSTRAT23 sur 174 272 SNP à l’échelle de l’autosome communs à tous les ensembles de données (générés à l’aide de 1M ou 610K Illumina, ou Affymetrix SNP6.0 arrays). Les données sur 10 Bushmen et 20 Xhosa24 ont été projetées avec 20 Yoruba et 20 Européens à partir des données disponibles (HapMap et Coriell), et 5 Bushmen (SAN) à partir des données du Human Genome Diversity Panel (HGDP). L’ACP à l’échelle de la population définit les Bushmen comme distincts des populations Niger-Congo et des Européens (Fig. 4a). L’analyse intra-africaine sépare les Bushmen des populations divergentes d’Afrique de l’Ouest et d’Afrique australe (Fig. 4b), tandis que l’ABT se situe clairement dans le groupe des Bantous du Sud. La parenté variable entre les Xhosa et les Yoruba peut suggérer un mélange passé et/ou une diversité historique au sein de cette population largement définie24. Au sein du groupe des Bushmen, nous prédisons que les Ju/’hoansi et les HGDP San sont essentiellement la même population. La divergence entre KB1 et MD8 peut être expliquée par un mélange bantou récent (supposé pour MD8) ou par des sous-populations uniques avec un petit pourcentage de mélange bantou ancien. Bien que limité par la taille de l’échantillon, un test sur quatre populations17 suggère une admixtion faible et/ou non concluante chez KB1 et nos participants Ju/’hoansi. Un test différent (voir tableau supplémentaire 14) montre un flux génétique entre les ancêtres de KB1 et ABT, confirmant les résultats mitochondriaux, mais sans déterminer la direction du flux. Contrairement à KB1, NB1 et TK1, le flux génétique entre les Bushmen et les Bantous d’Afrique australe a pu être confirmé grâce aux mitochondries de type L0 d’ABT et aux marqueurs chromosomiques Y spécifiques aux Bantous dans MD8. Pour savoir si les migrations sous-jacentes à ces instances ont suivi un modèle général de patri- ou de matrilocalité25, il faudra attendre une analyse détaillée de la structure de la population basée sur des réseaux à contenu nouveau qui incluent les 1,3 million de nouveaux marqueurs génétiques de cette étude.

Figure 4 : Structure de la population à trois voies basée sur 174 272 SNP autosomiques en utilisant l’ACP.
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a, b, L’ACP des Européens, des Africains (Niger-Congo) et des Bushmen (a) et des populations africaines uniquement (b) distingue les Bushmen des Yorubans et des Bantous. La fraction de la variance expliquée dans a est de 0,09 pour le vecteur propre 1 et de 0,04 pour le vecteur propre 2, alors que dans l’ACP b elle est de 0,06 et de 0,02, respectivement, avec une valeur P de Tracy-Widom <10-12. ABT, Bantou séquencé ; CEU, European HapMap ; JHO, locuteurs Juu (y compris NB1 et TK1) ; MD8, !Kung séquencé ; NOH, locuteurs Tuu (y compris KB1) ; SAE, Européen sud-africain ; SAN, HGDP San ; XHO, Xhosa sud-africain ; YRI, Yoruba HapMap.

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Comme les chasseurs-cueilleurs Bushmen n’ont jamais adopté de pratiques agricoles tout au long de leur histoire culturelle26, les variants de séquence trouvés dans leurs génomes peuvent refléter une adaptation ancienne à un mode de vie de recherche de nourriture. Dans le cas des Bushmen du Kalahari, l’adaptation à la vie dans des climats arides doit également s’être produite, car on a noté plusieurs traits phénotypiques qui sont absents chez d’autres groupes humains, comme la capacité de stocker de l’eau et des métabolites lipidiques dans les tissus corporels26. Ces différences physiologiques et génétiques pourraient orienter les études futures sur la question très débattue de savoir si le remplacement de population, plutôt que l’échange culturel, a conduit à l’expansion de l’agriculture dans les régions méridionales de l’Afrique27, comme cela a été observé pour les populations de la fin de l’âge de pierre en Europe28,29.

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